分光光度分析法的基本原则

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。它具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法。许多物质的测定都采用分光光度法。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。

基本原理：

选择吸收

物质与光作用，具有选择吸收的特性。有色物质的颜色是该物质与光作用产生的。即有色溶液所呈现的颜色是由于溶液中的物质对光的选择性吸收所致。由于不同的物质其分子结构不同，对不同波长光的吸收能力也不同，因此具有特征结构的结构集团，存在选择吸收特性的最大实收波长，形成最大吸收峰，而产生特有的吸收光谱。即使是相同的物质由于其含量不同，对光的吸收程度也不同。利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质的存在（定性分析），或利用物质对一定波长光的吸收程度来测定物质含量（定量分析）的方法，称为分光光度法。

定量依据：

朗伯一比尔（Lambert - Beer）定律是分光光度法定量分析依据的基本原理。当一束单色光（指路由一种颜色的光）通过一均匀的溶液时，一部分被吸收，一部分透过。设入射光的强度为I0，透射光强度为I，则I/I0为透光度，用T表示。百分透过率为 T% = （I/I0）x100%

研究表明：溶液对光的吸收程度即吸光度（A）（又称消光度E、或光密度D）与透光度（T）呈负对数关系，即：A = - lgT

朗伯定律：有色溶液的吸光程度（A）与其液层厚度（光程）b成正比。当溶液浓度不变时，溶液的液层厚度越大，对光的吸收程度A值越大，则透光度越小。

即：A = ab

比耳定律：有色溶液的吸光程度（A）与其浓度（吸光质点数）C成正比。即当溶液的液层厚度不变时，溶液的浓度越大，对光的吸收程度越大，则透光度越小。

即：A = ac

将以上两式合并可用下式表示：A = -lgT=abc

即 A = abc。

上式为朗伯比尔定律，其意义为：当一束单色光通过一均匀溶液时，溶液对单色光的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。[3][2]

A =abc 中，吸光系数a，表征吸光物质的 灵敏度。a值越大，灵敏度越高。如果浓度的单位为物质的量浓度（单位为：mol/L），则吸光系数a可以写成ε ，ε称为摩尔吸光系数。

由上式可知，当溶液层厚度b和吸光系数a固定时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长 ，然后以此波长 的光为光源（单色光），进行吸光度A的测定，这是朗伯比尔定律用于定量分析的首要条件。